本文來(lái)源：中國(guó)中藥雜志， 2017年17期 ：補(bǔ)體抑制活性物質(zhì)魚(yú)腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除，如需刪除請(qǐng)留意，謝謝。
[關(guān)鍵詞]
魚(yú)腥草總多糖、內(nèi)毒素、顯色法基質(zhì)鱟試劑盒、廈門鱟試劑、 抗補(bǔ)體、 疏水色譜、親和吸附色譜
[背景]
魚(yú)腥草Houttuynia Herba為三白草科Saururaceae蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗過(guò)敏、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[13]。補(bǔ)體系統(tǒng)（complement system）是將對(duì)病原體的識(shí)別有效地轉(zhuǎn)化為宿主對(duì)最初感染發(fā)揮防御功能的主要機(jī)制之一。補(bǔ)體的過(guò)度激活會(huì)引起人體免疫系統(tǒng)的過(guò)度反應(yīng)，參與多種疾病的病理過(guò)程[4]，臨床上目前尚無(wú)理想的治療藥物。近年來(lái)，本課題組致力于中藥補(bǔ)體抑制劑的研究，分離得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖類天然補(bǔ)體抑制劑[58]。其中，魚(yú)腥草總多糖抗補(bǔ)體活性較強(qiáng)[9]，同時(shí)具有顯著的解熱和防治內(nèi)毒素（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷藥效[1011]，臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景良好。
[摘要]
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)柱色譜聯(lián)用去除魚(yú)腥草總多糖中的LPS，以顯色基質(zhì)比色法定量檢測(cè)內(nèi)毒素含量，比較疏水色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用及凝膠過(guò)濾色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用對(duì)LPS的清除率，同時(shí)比較LPS清除前后魚(yú)腥草總多糖體外補(bǔ)體抑制活性的變化，為中藥活性多糖藥物中LPS的去除提供方法參考。
以下為部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分享，如需閱讀全文請(qǐng)與我司業(yè)務(wù)員聯(lián)系。
1 材料
魚(yú)腥草，經(jīng)鑒定為三白草科Saururaceae 蕺菜屬植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。魚(yú)腥草總多糖為采用課題組前期優(yōu)化工藝自制[9]。endprint
LPS對(duì)照品（Pharmacia Biotech）；顯色基質(zhì)法鱟試劑盒；透析袋。氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸及苯酚均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)，苯酚用前重熏。
廈門鱟試劑生物科技股份有限公司顯色基質(zhì)鱟試劑盒
電子天平，TDL4型低速臺(tái)式離心機(jī)，Well scan MK3型酶標(biāo)儀，EYELAOSB2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，精達(dá)水浴恒溫振蕩器，RLPHR 12 LD型冷凍干燥器，UV759S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，HL2S型橫流泵，BSZ100型自動(dòng)部分收集儀。
2 方法
2.1 顯色基質(zhì)法[21]定量檢測(cè)LPS含量
2.1.1 反應(yīng)試劑的配制 按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解鱟試劑，鱟試劑應(yīng)于溶解后10 min內(nèi)使用。按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水溶解顯色基質(zhì)。按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑HCl配制偶氮化試劑1。按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水溶解偶氮化試劑2，3。
2.1.2 對(duì)照品及待測(cè)樣品溶液的配制 精密稱取適量對(duì)照品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度分別為0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU·mL-1或0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU·mL-1。精密稱取適量待測(cè)樣品，加內(nèi)毒素檢查用水配制成待測(cè)樣品溶液。
2.1.3 陰性對(duì)照品溶液的配制 取100 μL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液及100 μL待測(cè)樣品溶液，加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，混勻，即為陰性對(duì)照品溶液。
2.1.4 內(nèi)毒素含量測(cè)定方法 取300 μL對(duì)照品，加入鱟試劑100 μL，混勻，根據(jù)其內(nèi)毒素濃度范圍分別于37 ℃溫浴45 min或8 min后，加入顯色基質(zhì)溶液100 μL，混勻，37 ℃溫浴6 min，繼續(xù)加入偶氮化試劑1、偶氮化試劑2和偶氮化試劑3溶液各500 μL，混勻靜置5 min，于545 nm下測(cè)定其吸光度。
以吸光度值為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。
陰性對(duì)照品溶液或待測(cè)樣品溶液的內(nèi)毒素濃度測(cè)量法同上。
2.1.5 供試品干擾實(shí)驗(yàn) 由于要考察試驗(yàn)中各因素對(duì)鱟試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品反應(yīng)的影響，故需進(jìn)行供試品干擾實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率?；厥章视?jì)算方式如下：
R=（Cs-Ct）/Cr×100%
Cr：選取靠近內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的濃度；Cs：配制含有內(nèi)毒素濃度為Cr的供試品溶液，其測(cè)量所得的內(nèi)毒素濃度值記為Cs；Ct：未添加內(nèi)毒素的供試品所測(cè)得的內(nèi)毒素濃度值。
當(dāng)R在50%～200%時(shí)，認(rèn)為此實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)供試品溶液不存在干擾。若R超出此范圍則需進(jìn)一步對(duì)供試品進(jìn)行稀釋，重復(fù)供試品干擾實(shí)驗(yàn)至R進(jìn)入50%～200%。一般選擇R接近100%時(shí)的供試品濃度進(jìn)行供試品的內(nèi)毒素含量測(cè)定。
3 結(jié)果
3.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程的建立
當(dāng)LPS濃度范圍為0.01～0.1 EU·mL-1時(shí)，回歸方程為Y=0.872 9X-0.040 9，R2=0.992 8；LPS濃度范圍為0.1～1.0 EU·mL-1時(shí)，回歸方程為Y=6.183 1X-0.002 5，R2=0.995 3。
3.2 魚(yú)腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除
3.2.1 凝膠過(guò)濾色譜法與親和吸附色譜法聯(lián)用 將魚(yú)腥草總多糖經(jīng)Sephacryl S300柱洗脫后的洗脫液6～10管合并、透析、凍干，記為H1；將H1樣品再次經(jīng)AffiPrep Polymyxin柱純化，其洗脫液的3～5管合并、透析、凍干，記為H1′， 見(jiàn)圖1。
3.2.2 疏水色譜法與親和吸附色譜法聯(lián)用 將魚(yú)腥草總多糖經(jīng)Penyl Sepharose 6 FF柱洗脫后的洗脫液6～13管合并、透析、凍干，記為H2；將H2樣品經(jīng)AffiPrep Polymyxin柱洗脫后的3～5管合并、透析、凍干，記為H2′，見(jiàn)圖2。
3.3 供試品干擾實(shí)驗(yàn)
為避免試驗(yàn)中各因素對(duì)鱟試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品反應(yīng)的影響，對(duì)供試品進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率，并選擇回收率接近100%時(shí)的供試品濃度進(jìn)行供試品的內(nèi)毒素含量測(cè)定。魚(yú)腥草總多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 79 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H1的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 78 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H1′的質(zhì)量濃度達(dá)到0.001 25 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H2的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 85 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H2′的質(zhì)量濃度達(dá)到0.001 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%，見(jiàn)表1。
3.4 內(nèi)毒素的含量測(cè)定與抗補(bǔ)體活性測(cè)定
取魚(yú)腥草總多糖及3.2項(xiàng)不同程度純化樣品H1， H1′， H2， H2′，根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別配置回收率接近100%的各樣品溶液，以2.4項(xiàng)所述方法測(cè)定其內(nèi)毒素含量；取上述各樣品按2.5項(xiàng)方法測(cè)定抗補(bǔ)體活性CH50。魚(yú)腥草總多糖不同方法純化前后的內(nèi)毒素含量及抗補(bǔ)體活性變化結(jié)果見(jiàn)表2。
LPS去除率=（總多糖LPS量-純化片段LPS量）/總多糖LPS量×100%